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        BioZol
        • 產品貨號:
          DE0107
        • 中文名稱:
          BioZol
        • 英文名稱:
          BioZol
        • 品牌:
          BIODEE
        • 貨號

          產品規格

          售價

          備注

        • DE0107-100ml

          100ml

          ¥433.00

          RNA提取

        產品描述

        產品簡介

        Biozol 可從各種真核培養細胞,動物組織, 細菌植物和真菌中快速高效提取總RNA, 整個實驗可控制在30分鐘內。 通常情況下可單次處理1 x 106個真核細胞, 1 x 109 個細菌細胞, 100 mg 動物或植物組織。
        本試劑盒純化的RNA可用于RT-PCR, Northern 雜交, mRNA純化,體外翻譯等下游實驗。
        原理
        細胞或組織經Biozol裂解, 試劑中的成分會抑制RNase活性。 加入氯仿抽提, 裂解液將分為水相和有機相。 RNA存在于水相中, 用異丙醇處理水相后,經過75%酒精的洗滌, 室溫晾干或真空干燥后用DEPC水洗脫就能得到高質量的RNA。
        貯存條件及其穩定性
        Biozol 試劑保存于4℃。 該產品可保證在購買之日起至少24 個月內有效。
        產品組分

        Catalog #

        DE0107

        Biozol 溶液

        100mL

        說明書

        1

        注: Biozol 溶液包含異硫氰酸胍和苯酚, 實驗時請格外小心。
        操作前請注意
        仔細閱讀說明書,熟悉相關步驟, 并準備好相關器材。

        實驗時, 戴好一次性手套減少RNase污染,使用一次性的RNase-free 槍頭。
        實驗操作盡量小心快速。

        實驗前要確定使用的樣品量, 最大用量是100 mg, 一些富含RNA的組織,我們建議使用30 mg的樣品。 如果一些RNA含量佷少的樣品, 那么樣品使用量增大為100 mg。
        組織勻漿
        A. 液氮研磨
        液氮研磨組織并立即置于液氮中冷凍,液氮下將組織研磨成細粉,將懸浮的粉末倒入預冷的離心管中, 注意預先冷卻離心管,否則樣品倒入時,液氮沸騰會損失樣品。在樣品融化前, 加入Biozol試劑。
        B. 轉子勻漿機勻漿
        帶轉子的機械勻漿器能高效、方便地勻漿大部分組織。 大部分勻漿器都帶有不同大小的針頭, 可處理比較微量的組織。
        C. 注射器方法
        由于高分子量DNA會提高細胞裂解液粘度,因為可以用小型針頭(19-21型) 抽打幾次以打斷DNA, 降低裂解液的粘度。
        需用戶準備的試劑
        ? 氯仿
        ? 異丙醇
        ? 無水酒精
        RNA提取操作步驟
        A : 真核細胞和組織RNA提取步驟
        1. 用1 mL Biozol 試劑 裂解細胞或組織
        1 mL Biozol溶液可以充分裂解107個細胞,或是100mg剪碎的組織(30mm3)
        對于單層培養細胞(成纖維細胞, 內皮細胞等)
        按下面的方法在培養瓶中直接裂解細胞: 盡量吸干培養基,然后直接將Biozol 溶液加入到培養皿。 用裂解液吸打培養皿上面的細胞,使全部細胞都裂解。轉移裂解液到1.5mL的離心管。 (這個辦法比用胰酶消化收集細胞好一些,因為這樣可以最大限度降低RNA酶對RNA的降解。)
        對于懸浮培養細胞

        用不超過1,500 rpm (400 x g) 離心 5分鐘.棄上清, 加入Biozol溶液, 漩渦混勻或槍頭吸打混勻。 然后轉移到1.5mL離心管。
        對于組織樣品
        按照樣品的類型,選擇一個較好的勻漿方法。除了液氮研磨以外,其他勻漿方法可直接在Biozol溶液 中操作。 其中對于特殊組織樣品如:肝、脾、骨及軟骨等需要將Biozol用量加大一倍或是降低樣品量。
        2. 在室溫下,靜置兩分鐘。
        3. 每1 mL Biozol 溶液加入0.2倍體積的氯仿(1 mL Biozol Reagent 對應加入0.2 mL 氯仿) , 蓋好蓋, 用手劇烈震蕩15秒。
        4. 4oC 下12,000 xg 離心 3 分鐘。 溶液分為酚氯仿相、 中間相和上層水相。RNA溶解在水相中。
        5. 轉移不超過80%的水相到一個干凈的離心管, 然后加入0.5倍體積的異丙醇(96-100%,室溫),漩渦充分震蕩15秒。
        6. 4oC 下12,000 x g 離心 10 分鐘, 離心后試管底部將出現沉淀。
        7. RNA沉淀的清洗: 沿管壁輕輕加入1mL 75%的乙醇(防止加入乙醇時沖散沉淀) , 用手輕輕震蕩離心管洗滌沉淀。 7500×g離心5分鐘, 棄上清, 盡量去除殘留乙醇, 這樣可以減少鹽離子污染。
        8. 重復第7步。
        9. RNA的溶解: 室溫晾干或真空干燥, (不要過于干燥, 否則RNA很難溶解) 然后加入30-50 μL DEPC 水溶解RNA, 待沉淀完全溶解后于-80℃保存。
        B: 細菌RNA提取步驟
        1. 采集菌體后懸浮于100 μL TE/lysozyme, 室溫下靜置7分鐘
        估算好細菌數, 109個菌體為佳, 4,000 x g 離心 5 分鐘,棄上清, 加入100μL 已添加溶菌酶的TE buffer。 (革蘭氏陰性菌加入0.5 mg/mL的溶菌酶;革蘭氏陽性菌4mg溶菌酶/mL的溶菌酶) 懸浮菌體, 然后室溫下靜置7分鐘。
        2. 加入1mL Biozol 溶液, 漩渦震蕩15 秒。 室溫靜置3分鐘。
        3. 每1 mL Biozol 溶液加入0.2倍體積的氯仿, 蓋好蓋, 用手劇烈震蕩15秒。
        4. 4oC 下12,000 x g 離心 3 分鐘 。溶液分為酚氯仿相、中間相和上層水相。RNA溶解在水相中。
        5. 轉移不超過80%的水相到一個干凈的離心管, 然后加入0.5倍體積的異丙醇((96-100%,室溫), 漩渦充分震蕩15秒。 這一步可能會瞬間產生沉淀, 這不影響RNA的純化。
        6. 4oC 下12,000 x g 離心 10 分鐘, 離心后試管底部將出現沉淀。
        7. 按照第5頁的方法操作7-9步。
        C: 植物和真菌RNA步驟
        按照這個實驗步驟可以簡單高效的從新鮮或冷凍的組織中高效的提取RNA 。 鑒
        于真菌和植物水分含量不一、變化幅度大, 而且含有多糖類,所以每次取樣不要超過100mg。 最好采集嫩葉或芽。 按照實驗步驟提取的 RNA足夠應用于Northern分析。
        實驗中穿戴乳膠手套, 把樣品放于1.5或2.0mL的離心管, 然后用鑷子夾取到液氮中冷凍,應用一次性的研缽研磨或其它器具研磨。 研磨過程中保持液氮蒸發, 研磨后的樣品可直接保存于-70 ℃。
        1. 采集研磨好的冷凍組織到離心管, 然后迅速加入1mL Biozol 溶液,漩渦充分震蕩30秒。保證所有的凝塊全部溶解。 溶解完全對RNA提取很關鍵。
        2. 室溫下靜置3分鐘。
        3. 每1 mL Biozol 溶液中加入0.2 mL的 氯仿。 蓋好蓋, 漩渦劇烈震蕩15秒。
        4. 4oC 下12,000 x g 離心 3 分鐘。溶液分為酚氯仿相、 中間相和上層水相。
        RNA溶解在水相中。
        5. 轉移不超過80%的水相到一個干凈的離心管, 然后加入0.5倍體積的異丙醇((96-100%,室溫), 漩渦充分震蕩15秒。 這一步可能會瞬間產生沉淀, 這不影響RNA的純化。
        6. 4oC 下12,000 x g 離心 10 分鐘, 離心后試管底部將出現沉淀。
        7. 按照第5頁的方法操作7-9步。
        Biozol RNA 提取試劑 Page 7
        DNA污染
        應用ezBind RNA spin柱可以去除絕大多數的DNA, 一般的RNA提取都不能完全去除基因組殘留。 對于下游敏感實驗如: RT-PCR或差異顯示, 我們建議在膜上進行DNA消化。 應用RNase-free的DNase來進行消化。 在一些RTPCR,如果應用體表表達引物,在有微量的DNA污染也無影響。 撥打熱線858-603-3219,我們這里提供體外引物的構建合成。
        RNA的定量和存儲
        測定260 nm 和 280 nm的吸光值可以測定RNA的濃度。 260nm1個OD值表示溶液RNA濃度是40 μg/mL,DEPC水呈酸性,會顯著降低260nm的吸光值。 我們 建議使用TE緩沖液來稀釋RNA進行OD值的測定。 純凈的RNA的OD A260/A280 比值是2.純凈的蛋白質OD A260 /A280的比值是0.6左右。 比值在1.8-2.0之間的話表示RNA純度是90%-100%。 (苯酚的最高吸光值在275nm, 會影響DNA和RNA的吸光值, 但是EzgeneTM Total RNA Kit解決了苯酚對吸光值的影響。 ) RNA溶于水后儲存于-70oC。 按照上面的方法提取的RNA可以保存超過一年。
        RNA質量
        注意 :在以后的應用前推介先測定 RNA 的質量。 收集的 RNA 質量可以用加入染色劑溴化乙錠的變性凝膠瓊脂進行電泳的辦法測定。我們將看到非常清晰的 28s and 18s 族 RNA 的特定條帶。 如果這些條帶不清晰并傾向于形成小分子 RNAs,這種情況說明在原料準備或操作過程或儲備中 RNA 發生了很嚴重的降解。 小于 200 堿基片段的 RNA 不能有效的結合到 RNA 柱子上。
        吸光值 A260/A280的比率在 1.8-2.0 說明提取的 RNA 的純度在 90-100%

         疑難問題解答

        問題

        可能原因

        改進建議

        少量或沒有RNA沉淀下來

        特 殊 樣 品 組織 , 極 度 分化、含細胞數量太少。

        ? 再次洗脫
        ? 洗脫前對DEPC-水預熱到65oC
        ? 離心前柱子在65oC預熱10分鐘
        ? 樣品不新鮮, RNA已全部降解了

        操 作 過 程 中RNA的丟失

        ? 實驗盡量快速小心
          ? 實驗器具保證RNase-free


        雜質過多

        裂解不充分

        ? 完全裂解溶液
          ? 減少起初樣品量
          ? 取上清液時盡量不要吸到中間相

        RNA發生降解

        樣品來源

        ? 盡快用液氮冷凍樣品
          ? 盡量使用新鮮的樣品提取RNA,或盡快裂解樣品。
          ? 盡可能按照說明書進行操作,快速操作。

        RNase污染

        ? 在操作過程中減少RNase污染
          ? 檢查緩沖液中是否有RNase污染


        下游實驗問題

        過多的鹽分

        ? 用75%的乙醇在進行一次洗滌
          ? 每次用75%乙醇洗滌后, 要盡量去除殘留75%乙醇
          ? 離心管壁也盡量用75%的乙醇洗滌

        DNA污染

        吸到中間相

        75oC下, 用 RNase-free DNase I 消化5分鐘

        Abs值偏低

        RNA在酸性的
          緩沖溶液或水
          中稀釋

        DEPC水是酸性的,會明顯的降低Abs260 值。用TE緩沖液稀釋RNA,然后用于分光光度分析。




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